تعیین توالی DNA و تکنیک سنگر
تعیین توالی یا تکنیک توالی یابی سنگر DNA روشی است که از دهه 70 درجهان آغاز شده و روشی برای شناسایی توالی بازهای آلی نیتروژن‌دار موجود در ژنوم مي باشد. تعيين توالي جهت تشخيص جهش و … وتعيين توالي تحقيقاتی معمولاً جهت شناسايي توالی ژن‌های جدید مورد استفاده قرارمي‌گیرد.
توالی یابی به روش سنگر sanger برگرفته از نام فردریک سنگر می باشد. این دانشمند، برنده جایزه نوبل در سال 1958 برای شناسایی توالی اسید آمینه پروتئین و در سال 1980 برای تعیین توالی DNA است. این روش که در حال حاضر دقیق‌ترین روش مستقیم برای تعیین جهش‌های بیماری‌زا است. این روش می‌تواند حتی اضافه، حذف یا تغییر یک نوکلئوتید را هم مشخص کن
یکی از روش های توالی یابی DNA بر پایه روش خاتمه زنجیره است. روش توالی یابی سنگر، روشی با کیفیت و قیمت مناسب است که در حداقل زمان ممکن جهت شناسایی قطعه خاصی از DNA بکار می رود. حداکثر طول قطعه قابل شناسایی توسط این روش در 600bp-700bp میباشد. با توجه به کیفیت بالای توالی یابی در شرکت میکروسینس در صورت مساعد بودن کیفیت محصول PCR ارسالی طول خوانش به 1100bp افزایش پیدا میکند.
میکروسینس سوئیس
این خدمت توسط شرکت یاس ژن و در خارج از کشور به صورت ارسال به خارج قابل انجام است. نمونه های ارسالی به کشور سوئیس و شرکت میکروسینس ارسال می شود. میکروسینس با بیش از 6 دهه فعالیت مستمر در زمینه ارائه خدمات بیوتکنولوژی فعال است.
- ابتدا فرم مربوط به توالی یابی سنگر که در را دانلود و با دقت پر کنید. جهت راهنمایی پر کردن فرم ادامه همین مقاله را مطالعه بفرمایید.
- سپس فرم پر شده را به آدرس ایمیل info@yasgene.com ارسال نمایید.
- عکس ژل آگارز را حتما در فرم درخواست بارگذاری نمایید.
- پیش فاکتور طی یک روز کاری برای شما ارسال میشود.
- پس از تایید پیش فاکتور نسبت به پرداخت آن اقدام فرمایید و فیش واریزی را به ایمیلinfo@yasgene.com ارسال نمایید.
- نمونه های خود را پس از پرداخت به نشانی شرکت ارسال نمایید. لازم به ذکر است ارسال نمونه به نحوی باشد که در روزهای کاری شرکت به مقصد برسد.
- نتایج توالی یابی شما حداکثر دو هفته کاری پس از ارسال نمونه به نشانی ایمیل اعلامی در فرم درخواست ارسال خواهد شد.
- نمونه ها داخل تیوب 1.5 باشند.
- حداقل حجم ارسالی برای یک بار خوانش 20μl و برای دوبار خوانش 40μl باشد.
- کمترین حجم پرایمر برای یکبار خوانش 20μl و به ازای هر خوانش اضافه 5μl اضافه شود.
- پرایمر ها به نسبت یک به ده رقیق شده و در تیوب 1.5 ارسال گردد.
- سعی کنید بسته بندی مناسبی برای ارسال نمونه انتخاب کنید.
- از پوشاندن درب میکروتیوب با چسب خودداری نمایید و حتی المقدور از پارافیلم برای پوشاندن درب تیوب ها استفاده نمایید.
نام نمونه
برای وارد کردن نام نمونه از این الگوریتم استفاده کنید:
ابتدای نام لاتین شما + ابتدای فامیلی لاتین شما + 001
برای مثال فرض میکنیم شخصی با نام علی شاهرودی می خواهد نمونه خود را نامگذاری کند، نام نمونه اول این شخص ASH001 و نام نمونه دوم این فرد ASH002 و … می باشد.
توجه داشته باشد نام وارد شده در فرم درخواست حتما همان نامی باشد که روی ویال نمونه ارسالی نوشته می شود.
نوع DNA
درصورت ارسال نمونه به صورت محصول PCR گزینه PCR را را انتخاب نمایید و درصورتی که پلازمید ارسال گردیده، گزینه Plasmid را انتخاب بفرمایید.
منبع پرایمر
در صورت استفاده از پرایمر های اختصاصی گزینه Enclosed in Separate Tube و در صورت استفاده از پرایمرهای استاندارد شرکت میکروسینز Topaz Primer List را انتخاب نمایید. جهت مشاهده لیست پرایمر های میکرو سینز اینجا کلیک کنید.
نام پرایمر
در این قسمت نام پرایمر مورد استفاده برای خوانش نمونه ذکر شود. نام پرایمر نوشته شده روی تیوب ارسالی حتما با نامی که در این بخش نوشته می شود یکسان باشد.
طول قطعه
در این بخش طول قطعه محصول PCR خود را وارد کنید.
خالص سازی محصول PCR
خالص سازی محصول PCR با حذف آلودگی ها منجر به کسب نتیجه بهتر از توالی یابی می شود. در صورتی که نیاز به انجام خالص سازی برای نمونه دارید گزینه Yes و در غیر اینصورت گزینه No را انتخاب کنید.
عکس ژل
لطفا نسبت به بارگذاری عکس ژل در فرم درخواست اقدام فرمایید.
آیا نیاز به قرار دادن آیس ژل در کنار نمونه ها هنگام ارسال است ؟
از چه نرم افزاری برای باز کردن نتایج استفاده کنیم؟
توالی یابی به روش سنگر sanger به 2 طریق قابل انجام است:
- Gel Electrophoresis
- Capillary Electrophoresis
در این مقاله به روش دوم پرداخته خواهد شد
نحوه انجام تست
برای توالی‌یابی قطعه DNA، ابتدا لازم است مواد انجام واکنش را در ویال مخلوط کنیم:
- قطعه DNA مورد نظر
- پرایمر
- آنزیم DNAپلیمراز
- dNTPs
- ddNTPs های نشان‌دار
تفاوت dNTPs و ddNTPs در توالی یابی به روش سنگر sanger
dNTPها در واقع دئوکسی‌نوکلئوتید هستند و در کربن شماره 3′ قند، عامل هیدروکسیل (OH) دارند اما ddNTPها دای‌دئوکسی‌نوکلئوتیداند و کربن 3′ قندشان فقط هیدروژن دارد و اکسیژن ندارد. 3′ هیدروکسیل، عامل اتصال نوکلئوتیدها بوده و عدم وجود این عامل باعث میشود تا نوکلئوتید جدیدی نتواند به ddNTPها متصل شود.
هرکدام از ddNTPها با رنگ فلورسنس مشخصی نشان‌دار شده‌اند که باعث میشود بتوانند نورهایی با طول موج‌های متفاوتی از هم نشر کنند. برای مثال نوکلئوتید A نورسبز، نوکلئوتید T رنگ زرد، نوکلئوتید C رنگ صورتی و نوکلئوتید G رنگ خاکستری را از خودشان نشر دهند.
حال محلولی را که در ویال آماده کردید را داخل دستگاه ترموسایکلر قرار می‌دهیم.
اتفاقات درون ترموسایکلر
- Denaturation
با افزایش دما در حدود 95 درجه، دو رشته DNA از هم باز می‌شوند.
- Annealing
با کاهش دما تا حدود 50 درجه، پرایمرها به رشته DNA متصل می‌شوند.
- Extension
با افزایش مجدد دما تا حدود 60 درجه، DNAپلیمراز واکنش پلیمریزاسیون را انجام خواهد داد.
برای آشنایی بیشتر با دستگاه‌های توالی یابی به مقاله‌های یاس‌ژن مراجعه کنید.
دقت کنید که اگر DNAپلیمرازها به جای dNTPs از ddNTPs استفاده کنند، واکنش پلیمریزاسیون ادامه خواهد یافت و در سیکل‌های بعدی هم این استفاده مجددا انجام خواهد شد اما به دلیل رندوم بودن انتخاب dNTPها توسط DNAپلیمراز، ممکن است در سیکل‌های بعدی واکنش پلیمریزاسیون با طول‌های متفاوتی خاتمه پیدا کند.
در نهایت از یک قطعه DNA، کپی‌های متعددی ساخته میشود که در نوکلئوتیدهای متفاوت و در طول‌های مختلفی خاتمه پیدا کرده‌اند.پس از تکثیر قطعه موردنظرمان، زمان پیداکردن توالی می‌رسد. برای این کار از دستگاه “Capillary Electrophoresis” استفاده می‌کنید.
اساس کار این دستگاه به اینگونه است که قطعات DNA تکثیر شده، وارد قطب منفی می‌شوند. سپس با برقراری جریان در مدار، قطعات DNA از طریق یک لوله مویین به سمت قطب مثبت حرکت می‌کنند. DNA به دلیل داشتن گروه‌های فسفات در ساختار خود، دارای بار منفی است و همین بار منفی باعث میشود تا قطعات DNA به سمت قطب مثبت حرکت کنند. قطعاتی که درحین پلیمریزاسیون زودتر پلیمریزه شدند، کوتاه‌ترند، تندتر حرکت می‌کنند و به این ترتیب می‌توانند سریع‌تر به قطب مثبت برسند.
Detection توالی یابی به روش سنگر
درمسیر حرکت قطعات DNA، یک دتکتور وجود دارد که می‌تواند نورفلورسنس ddNTPها را تشخیص دهد.سیگنال‌هایی که توسط دتکتور تشخیص داده می‌شوند، به یک مانیتور منتقل شده و نشان داده می‌شوند.حال با داشتن سیگنال‌ها، می‌توان نوع نوکلئوتیدها را تشخیص داد و اینگونه با قرار دادن نوکلئوتیدها کنار هم، توالی DNA موردنظرمان به دست می‌آید و با داشتن توالی یک رشته، می‌توان توالی رشته مکمل را هم تشخیص داد.
شرکت یاس ژن پیشرو در تامین تجهیزات و مواد اولیه تکنیک sanger sequencing با سالها تجربه آماده ارایه مشاوره جهت خرید و راه اندازی تجهیزات از کمپانی Thermo Fisher و سایر برندهای معتبر می باشد.
Add a Comment