سنتز complementary DNA به کمک آنزیم Reverse Transcriptase

برای بررسی بیان ژن‌های خاص در یک نمونه و بررسی حضور ژن موردنظر مثل تشخیص بیماری،پس از استخراج RNA از نمونه مدنظر باید تست ریل تایم RT-PCT انجام داده شود. اما RNA پایداری مناسب برای این تست را ندارد.پس لازم است ابتدا آن را به cDNA یا complementary DNA تبدیل کنیم به صورت (سنتز cDNA به کمک آنزیم RT ) این کار با استفاده از آنزیم ریورس ترنسکریپتاز(Reverse Transcriptase) در دستگاه ترموسایکلر انجام می‌شود.

جهت سنتز cDNA به کمک آنزیم RT موارد زیر را بررسی میکنیم:

هنگام انجام PCR،نمی‌توان به 2دلیل به طور مستقیم از RNA استفاده کرد.

اول اینکه  RNA تک‌رشته‌ای است و در دمای 95درجه تخریب می‌شود. مورد بعدی اینکه آنزیم PCR،Taq polymerase است و این آنزیم RNA را به عنوان سوبسترا تشخیص نمی‌دهد. لذا از روی RNA ،یک ر شته مکمل یا cDNA را می‌سازند.

برای بیان سنجش مولکولDNA،2 راه وجود دارد:

1.بررسی مقدارRNA تولیدی در سلول

2.مقدار پروتئین ترجمه شده

پروتئین‌ها برای بررسی بیانDNA‌های یک سلول گزینه مناسب نیستند زیرا تمامی RNAهای تولیدی در یک سلول ممکن است ترجمه نشده باشند.

برای همین بررسی مقدارRNA  مفیدتر است زیرا دراینصورت می‌توان علاوه بر RNAهای ترجمه شده،RNAهایی هم که در تنطیم بیان ژن نقش دارند را هم بررسی کرد.

برای بیان ژنDNA، نمی‌توان به طور مستقیم از خود DNA‌ استفاده کرد زیرا غلظت DNA‌ به طور تقریب در تمامی سلول‌های بافت یا بدن موجود زنده،یکسان است.

در ساختار مولکولیRNA نسبت به DNA،یک گروه هیدروکسیل اضافی در کربن شماره 2 قند وجود دارد که این گروه هیدروکسیل اضافی، واکنش‌پذیری و آسیب‌پذیری RNA را نسبت به DNA افزایش می‌دهد. برای‌همین RNAگزینه مناسبی برای انجام آزمایشات نهایی نمی‌باشد،پس محققان برای انجام صحیح آزمایشات خود،پس از استخراجRNA،از روی توالی آن یک مولکول DNAمی‌سازند که این مولکول تازه ساخت را cDNA می‌نامند.

برای تهیه کیت  سنتزcDNA بر روی این قسمت کلیک کنید.

cDNA مخفف شده عبارتِ ”Complementary DNA” می باشد که تولید این مولکول توسط آنزیم Reverse Transcriptase به انجام خواهد رسید.

در خصوص سنتز cDNA ،باید موادی تهیه شود که فرایند سنتز را انجام دهند.

این مواد شامل:

آنزیم Reverse Transcriptase

پرایمر

 dNTP (نوکلئوتید‌های واکنش)

آب DEPC(کمک به سلامت RNA)

RNase inhibitor (برای جلوگیری از فعالیت Rnaseها)

انتخاب آنزیم:

آنزیم پایه MMLV است که کار مربوطه را انجام می‌دهد ولی دارای محدودیت‌هایی است.این آنزیم درحداکثر دمای 37درجه می‌تواند کارکند،یعنی اگر توالی دارای تعداد CG بالایی باشد،فعالیت آنزیم دچار اختلال خواهد شد. انتخاب بهتر،آنزیم ƖƖƖSSاست که در دماهای بالاتر هم می‌تواند فعالیت کند.

انتخاب پرایمر:

یکی از پرایمرهای مصرفی در این زمینه،Oligo dt  است.اگر بخواهید فقط mRNA را بررسی کنید،پرایمر الیگوdt  کافی است ولی درنهایت cDNA تولیدی کم خواهد بود.

مورد بعدی پرایمر رندوم هگزامر است و زمانی استفاده می‌شود که فقط بررسی mRNA مدنظر نیست و یا اینکه نمونه یوکاریوتی نباشد.این پرایمر مانع از ایجاد دوباره ساختارهای ثانویه می‌شود و مقدار زیادی cDNAرا تولید خواهد کرد.

نوع جدیدی از پرایمر با عنوان ژن اختصاصی(Gene specific)وجود دارد که از ترکیب دو پرایمر قبلی است.این پرایمر در ریل تایم تک‌مرحله‌ای استفاده می‌شود  و میزان cDNA تولیدی زیاد نخواهد بود.

برای استعلام قیمت بهترین دستگاه‌های ریل‌تایم برروی این قسمت کلیک کنید.

مواد را باهم مخلوط کنید و به مدت 5دقیقه در دمای 70درجه بگذارید به این منظور که ساختارهای RNA از هم باز شود.سپس برای ایجاد شوک دمایی و جلوگیری از تشکیل دوباره ساختارهای ثانویه،نمونه را به مدت 1دقیقه روی یخ قرار دهید.

حال نمونه را در دستگاه PCR قرار داده تا دستگاه طبق فرمول‌های از قبل تعیین شده، cDNAنمودار‌های انجام واکنش‌ها را نمایش دهد.

دستگاه PCR مهم‌ترین دستگاهی است که در فرایند سنتز نقش دارد. cDNAشما می‌توانید این دستگاه را از شرکت یاس ژن کوثر تهیه فرمایید