نام فارسی محصول : ترایزول
Product Name : Trizol
Catalog number : LB38055
Company : Life Biolab
ترایزول (Trizol) یک معرف آماده‌ی استفاده برای استخراج RNA کل از سلول‌ها و بافت‌ها برای استفاده در تحلیل PCR است. ترایزول (Trizol) یک محلول تک‌فازی از فنل و گوانیدین ایزوتیوسیانات است. در طی هموژنیزاسیون یا لیز بافت، تریزول یکپارچگی RNA را حفظ می‌کند، در حالی که سلول‌ها را مختل کرده و اجزای سلولی را حل می‌کند. افزودن کلروفرم و به دنبال آن سانتریفیوژ، محلول را به دو فاز آبی و آلی جدا می‌کند. RNA در فاز آبی باقی می‌ماند و با ایزوپروپانول رسوب داده می‌شود. RNA در آب عاری از نوکلئاز حل شده و برای تحقیقات ذخیره می‌شود.
الف. هنگام کار با تمام مایعات بدن، بافت‌ها و کشت‌های سلولی، از اقدامات احتیاطی استاندارد استفاده کنید. به بخش جمع‌آوری نمونه مراجعه کنید.
ب. ترایزول (Trizol) در صورت تماس با پوست و بلعیدن سمی است و باعث سوختگی می‌شود. هنگام کار با تریزول حتماً از لباس آزمایشگاهی، دستکش و عینک ایمنی استفاده کنید. در صورت تماس با پوست، بلافاصله با آب و صابون فراوان بشویید.
ج. برای جلوگیری از آلودگی با RNase، همیشه از دستکش استفاده کنید. از ظروف پلاستیکی یکبار مصرف و پیپت‌های مخصوص کار با RNA استفاده کنید تا از آلودگی متقابل با RNase از تجهیزات مشترک جلوگیری شود.
قبل از شروع کار با ترایزول (Trizol)
مواد مورد نیاز
کلروفرم، آب DEPC، اتانول ۷۵٪، ایزوپروپانول.
مواد اولیه:
سلول‌ها در کشت تک لایه/سوسپانسیون: تا ۱×۱۰^۷ سلول، بسته به نوع سلول.
سلول‌های باکتریایی: تا ۱×۱۰^۷ سلول.
بافت: تا ۱۰۰ میلی‌گرم.
گیاهان و قارچ‌ها: تا ۱۰۰ میلی‌گرم.
مواد مایع (مانند سرم): ۱۰۰ میکرولیتر.
خون کامل: ۵۰۰ میکرولیتر (تا ۲ میلی‌لیتر).
توجه: برای استخراج RNA از خون، از نمونه خون تازه استفاده کنید. قبل از استخراج RNA از خون کامل، گلبول‌های قرمز (RBC) باید با بافر لیز RBC حذف شوند و از گلبول‌های سفید (WBC) به عنوان ماده اولیه استفاده شود.
اختلال/هموژنیزاسیون
دو مرحله متمایز و ضروری برای استخراج RNA وجود دارد: اختلال و هموژنیزاسیون نمونه. اختلال و هموژنیزاسیون ناکافی به طور قابل توجهی بازده RNA را کاهش می‌دهد. روش‌های اختلال/هموژنیزاسیون نمونه:
سلول‌ها، رسوب WBC و مواد مایع: اختلال/هموژنیزاسیون با ورتکس در ترایزول (Trizol).
بافت، گیاهان و قارچ‌های رشته‌ای: اختلال با هاون و دسته‌هاون در نیتروژن مایع / هموژنیزاسیون با سرنگ و سوزن در تریزول.
پروتکل استخراج RNA با ترایزول (Trizol)
۱. ۱ میلی‌لیتر محلول ترایزول (Trizol) سرد به لوله‌ی ۲ میلی‌لیتری حاوی نمونه هموژنیزه اضافه کنید.
۲. به مدت ۵-۱۰ ثانیه ورتکس کنید و به مدت ۵-۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
۳. ۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم اضافه کنید. لوله‌ها را به مدت ۱۵ ثانیه به شدت تکان دهید و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید (ورتکس نکنید).
۴. نمونه‌ها را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و با سرعت ۱۲۰۰۰× g سانتریفیوژ کنید.
۵. فاز آبی (فاز بالایی) را به لوله‌ی ۱.۵ میلی‌لیتری عاری از RNase منتقل کنید؛ فاز میانی را مختل نکنید. RNA را با مخلوط کردن حجم مساوی ایزوپروپانول رسوب دهید.
۶. به آرامی با پیپت کردن مخلوط کنید (ورتکس نکنید)، سپس به مدت ۱۵ دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
۷. مخلوط را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و با سرعت ۱۲۰۰۰× g سانتریفیوژ کنید.
۸. سوپرناتانت را دور بریزید و ۱ میلی‌لیتر اتانول ۷۵٪ اضافه کنید، به مدت ۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد و با سرعت ۸۵۰۰× g سانتریفیوژ کنید.
۹. سوپرناتانت را دور بریزید و اجازه دهید رسوب در دمای اتاق به مدت چند دقیقه خشک شود (رسوب را بیش از حد خشک نکنید).
۱۰. رسوب را در ۵۰ میکرولیتر آب تیمار شده با DEPC حل کنید و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۵۵ تا ۶۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
کاربردهای بعدی
RT-PCR، سنتز cDNA، Northern blot، dot blot، slot blot، Primer extension، انتخاب Poly A+ RNA و غیره.
راهنمای عیب‌یابی استخراج با ترایزول (Trizol)
بازده مورد انتظار RNA به ازای هر میلی‌گرم بافت یا ۱×۱۰^۶ سلول کشت شده:
کبد و طحال: ۶-۱۰ میکروگرم
عضلات اسکلتی و مغز: ۱-۱.۵ میکروگرم
جفت: ۱-۴ میکروگرم
سلول‌های اپیتلیال (۱×۱۰^۶ سلول کشت شده): ۸-۱۵ میکروگرم
فیبروبلاست‌ها (۱×۱۰^۶ سلول کشت شده): ۵-۷ میکروگرمبازده کم
هموژنیزاسیون یا لیز ناقص نمونه. رسوب RNA به طور کامل حل نشده است.نسبت A260/A280 کمتر از ۱.۶۵
نمونه RNA در آب به جای TE قبل از آنالیز طیف‌سنجی رقیق شده است. محلول‌های با قدرت یونی کم و pH پایین جذب در ۲۸۰ نانومتر را افزایش می‌دهند. نمونه در حجم بسیار کمی از معرف هموژنیزه شده است. پس از هموژنیزاسیون، نمونه‌ها به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری نشده‌اند. فاز آبی با فاز فنل آلوده شده است. رسوب RNA در ترایزول (Trizol) به طور کامل حل نشده است.تجزیه RNA
بافت‌ها بلافاصله پس از جدا شدن از حیوان پردازش یا منجمد نشده‌اند. نمونه‌های استفاده شده برای استخراج یا آماده‌سازی‌های RNA در دمای ۵- تا ۲۰- درجه سانتی‌گراد به جای ۶۰- تا ۷۰- درجه سانتی‌گراد ذخیره شده‌اند. سلول‌ها با تریپسین هضم شده‌اند. محلول‌های آبی یا لوله‌ها عاری از RNase نبوده‌اند. فرمالدئید استفاده شده برای الکتروفورز ژل آگاروز pH کمتر از ۳.۵ داشته است.آلودگی DNA
نمونه در حجم بسیار کمی از معرف هموژنیزه شده است. نمونه‌های استفاده شده برای استخراج حاوی حلال‌های آلی (مانند اتانول، DMSO)، بافرهای قوی یا ترایزول (Trizol) یا محلول‌های قلیایی بوده‌اند.آلودگی پروتئوگلیکان و پلی‌ساکارید
این تغییر در رسوب RNA (رسوب RNA) این ترکیبات آلوده‌کننده را از RNA جدا شده حذف می‌کند. به فاز آبی ۰.۲۵ میلی‌لیتر ایزوپروپانول و سپس ۰.۲۵ میلی‌لیتر محلول رسوب نمکی بالا (۰.۸ M سیترات سدیم و ۱.۲ M NaCl) به ازای هر ۱ میلی‌لیتر معرف استفاده شده برای هموژنیزاسیون اضافه کنید. محلول حاصل را مخلوط کنید، سانتریفیوژ کنید و همانند پروتکل شرح داده شده ادامه دهید. این تغییر در رسوب RNA به طور موثر RNA را رسوب می‌دهد در حالی که پلی‌ساکاریدها و پروتئوگلیکان‌ها را در حالت محلول نگه می‌دارد.
