کیت استخراج؛ پایهی یک نتیجه دقیق
کیت استخراج چیست؟ راهنمای کامل انتخاب کیت استخراج DNA، RNA، پلاسمید و اسیدهای نوکلئیک
در بسیاری از آزمایشهای مولکولی، موفقیت آزمایش از جایی شروع میشود که شاید کمتر به آن توجه کنیم: مرحله استخراج و خالصسازی اسیدهای نوکلئیک.
قبل از PCR، Real-Time PCR، RT-PCR، کلونینگ، توالییابی یا بسیاری از آزمایشهای مولکولی دیگر، باید DNA یا RNA با کیفیت مناسب از نمونه اولیه جدا و خالصسازی شود. اگر این مرحله بهدرستی انجام نشود، حتی بهترین دستگاه PCR و گرانترین Master Mix نیز نمیتوانند نتیجه مطلوب را تضمین کنند.
اینجاست که کیت استخراج اهمیت پیدا میکند.
امروزه انواع مختلفی از کیتهای استخراج برای نمونهها و اهداف متفاوت وجود دارد؛ از کیت استخراج DNA ژنومی از خون و بافت گرفته تا کیت استخراج RNA، کیت استخراج DNA/RNA ویروسی، کیت استخراج پلاسمید، کیت استخراج DNA باکتریایی، کیت استخراج از گیاه، FFPE و حتی کیتهای تخصصی برای miRNA و cfDNA.
اما سؤال مهم این است:
کدام کیت استخراج برای آزمایش شما مناسب است؟
در این مقاله، انواع کیت استخراج اسیدهای نوکلئیک، فناوریهای مورد استفاده، تفاوت کیتها و مهمترین نکاتی که هنگام خرید کیت استخراج باید در نظر بگیرید را بررسی میکنیم.
کیت استخراج چیست؟
کیت استخراج مجموعهای از محلولها، ستونها، ذرات مغناطیسی یا سایر اجزای مورد نیاز برای جداسازی و خالصسازی DNA یا RNA از یک نمونه بیولوژیک است.
هدف اصلی این کیتها این است که مولکول موردنظر از ترکیبات مزاحم مانند:
- پروتئینها
- لیپیدها
- نمکها
- بقایای سلولی
- آنزیمها
- مهارکنندههای PCR
- و سایر ترکیبات موجود در نمونه
جدا شود و در نهایت DNA یا RNA نسبتاً خالص و مناسب برای آزمایش بعدی به دست آید.
در بسیاری از کیتهای مدرن، فرایند کلی بر اساس سه مرحله اصلی Bind، Wash و Elute انجام میشود؛ یعنی اسید نوکلئیک به یک سطح متصل میشود، ناخالصیها شسته میشوند و سپس DNA یا RNA در حجم مشخصی بازیابی میشود. این منطق هم در سیستمهای مبتنی بر سیلیکا و هم در بسیاری از سیستمهای Magnetic Bead استفاده میشود.
چرا انتخاب کیت استخراج اهمیت دارد؟
همه کیتهای استخراج برای همه نمونه ها مناسب نیستند.برای مثال، کیتی که برای استخراج DNA از خون طراحی شده است الزاماً بهترین انتخاب برای:
- RNA از بافت
- DNA پلاسمیدی
- DNA گیاهی
- DNA باکتری
- RNA ویروسی
- یا DNA موجود در نمونه FFPE
حتی اگر در تمام این موارد محصول نهایی “DNA” باشد، ماهیت نمونه و نیاز آزمایش بعدی متفاوت است.به همین دلیل هنگام انتخاب کیت استخراج باید حداقل چهار سؤال را پاسخ دهید:
۱. چه چیزی میخواهید استخراج کنید؟
DNA؟ RNA؟ پلاسمید؟ DNA/RNA ویروسی؟ miRNA؟
۲. نمونه شما چیست؟
خون؟ بافت؟ سلول؟ باکتری؟ گیاه؟ سواب؟ سرم؟ پلاسما؟
۳. قرار است بعد از استخراج چه کاری انجام دهید؟
PCR؟ qPCR؟ RT-PCR؟ NGS؟ کلونینگ؟ ترنسفکشن؟
۴. چه تعداد نمونه دارید؟
استخراج دستی چند نمونه با استخراج صدها نمونه در آزمایشگاه High-throughput کاملاً متفاوت است.
انواع کیت استخراج اسیدهای نوکلئیک
۱. کیت استخراج DNA ژنومی
یکی از پرکاربردترین گروههای کیت استخراج، کیتهای استخراج DNA ژنومی یا Genomic DNA هستند.این کیتها برای استخراج DNA از سلولها و بافتهای مختلف طراحی میشوند، از جمله:
- خون
- Buffy coat
- سلولهای کشتشده
- بافت حیوانی
- بزاق
- سواب
- باکتری
- مخمر
- نمونه های گیاهی
انتخاب کیت مناسب در این بخش تا حد زیادی به نوع نمونه وابسته است.برای مثال، استخراج DNA از خون کامل با استخراج DNA از بافت یا باکتری به مراحل لیز و شرایط شیمیایی متفاوتی نیاز دارد.DNA استخراج شده میتواند برای کاربردهایی مانند:
- PCR
- Real-Time PCR
- Genotyping
- Sequencing
- Cloning
مورد استفاده قرار گیرد. محصولات تجاری موجود نیز معمولاً بر اساس نوع نمونه و کاربرد نهایی بهصورت تخصصی طراحی شدهاند.
۲. کیت استخراج RNA
RNA نسبت به DNA حساستر است و همین موضوع باعث میشود انتخاب کیت استخراج RNA اهمیت بیشتری داشته باشد.کیتهای استخراج RNA برای جداسازی Total RNA، RNA ویروسی، RNA از سلول و بافت و برخی انواع RNAهای کوچک طراحی می شوند.در این نوع استخراج باید به موضوعاتی مانند:
- RNase contamination
- تخریب RNA
- خلوص RNA
- یکپارچگی RNA
- حذف DNA ژنومی
توجه ویژه داشت.RNA استخراج شده میتواند در آزمایشهایی مانند:
- RT-PCR
- RT-qPCR
- Gene Expression Analysis
- RNA Sequencing
برخی کیتها نیز برای استخراج RNA از نمونه های خاص مانند خون، بافت، گیاه، باکتری یا سلول طراحی شدهاند.
۳. کیت استخراج DNA/RNA ویروسی
یکی از دسته های مهم کیت استخراج، Viral Nucleic Acid Extraction Kits است.این کیتها برای استخراج DNA یا RNA پاتوژنها از نمونه هایی مانند:
- سرم
- پلاسما
- CSF
- سواب
- بزاق
- نمونههای تنفسی
- و برخی نمونههای بالینی دیگر
بسته به محصول، کیت میتواند برای استخراج RNA ویروسی، DNA ویروسی یا Total Viral Nucleic Acid طراحی شده باشد.برای مثال، کیتهای تجاری مختلفی وجود دارند که استخراج اسیدهای نوکلئیک ویروسی را با Spin Column یا Magnetic Bead انجام میدهند و برای پردازش تعداد بیشتری نمونه نیز نسخه های High-throughput دارند.
۴. کیت استخراج پلاسمید
اگر با کلونینگ، مهندسی ژنتیک یا ترنسفکشن کار میکنید، احتمالاً با Plasmid Extraction Kit یا Plasmid Miniprep Kit سروکار داشته اید.پلاسمید معمولاً از کشت باکتریایی، بهخصوص E. coli، استخراج می شود.مراحل عمومی استخراج پلاسمید شامل:
Pellet → Resuspension → Lysis → Neutralization → Removal of debris → Binding → Washing → Elution است.اما کیتهای استخراج پلاسمید فقط بر اساس مقدار DNA با یکدیگر تفاوت ندارند.انواع رایج شامل:
- Plasmid Miniprep
- Plasmid Midiprep
- Plasmid Maxiprep
همچنین برای کاربردهای حساستر، خلوص پلاسمید و سطح Endotoxin اهمیت زیادی دارد؛ بهخصوص زمانی که DNA برای کاربردهایی مانند Transfection استفاده می شود.در نتیجه، هنگام خرید کیت استخراج پلاسمید باید علاوه بر Yield، به کیفیت و کاربرد نهایی DNA نیز توجه کرد.
۵. کیت استخراج DNA باکتریایی
برای استخراج DNA از باکتریها نیز کیتهای اختصاصی وجود دارد.یکی از نکات مهم در این زمینه تفاوت ساختار دیواره سلولی باکتریها است.برای برخی باکتریها، به خصوص باکتریهای دارای دیواره سلولی مقاوم، ممکن است مرحله لیز بهینه شده یا استفاده از آنزیمهایی مانند Lysozyme مورد نیاز باشد.به همین دلیل اگر هدف شما استخراج DNA باکتریایی است، بهتر است کیتی انتخاب شود که نمونه موردنظر شما را بهطور مشخص پوشش دهد.DNA استخراج شده از باکتری میتواند برای:
- PCR
- Identification
- Genotyping
- Sequencing
- Molecular Microbiology
۶. کیت استخراج DNA و RNA گیاهی
نمونه های گیاهی یکی از چالش برانگیزترین نمونه ها برای استخراج اسیدهای نوکلئیک هستند.وجود ترکیباتی مانند:
- پلیفنولها
- پلیساکاریدها
- متابولیتهای ثانویه
- رنگدانه ها
میتواند روی کیفیت DNA یا RNA اثر بگذارد.به همین دلیل، کیت استخراج DNA گیاهی و کیت استخراج RNA گیاهی معمولاً دارای شیمی و مراحل بهینه شده برای این نوع نمونه ها هستند.
انتخاب کیت مناسب میتواند تأثیر مستقیمی بر کیفیت DNA/RNA و عملکرد آزمایشهای بعدی مانند PCR و qPCR داشته باشد.
۷. کیت استخراج از FFPE
نمونه های Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded یا FFPE شرایط متفاوتی نسبت به نمونه های تازه دارند.فرایند Fixation و قرار گرفتن نمونه در پارافین میتواند روی کیفیت و یکپارچگی اسیدهای نوکلئیک اثر بگذارد.به همین دلیل برای این نمونه ها، کیتهای اختصاصی استخراج DNA یا RNA وجود دارد که مراحل آنها برای بازیابی اسیدهای نوکلئیک از بافتهای پارافینه طراحی شده است.این دسته برای پژوهش های:
- سرطان
- پاتولوژی مولکولی
- Biomarker Research
- Molecular Profiling
۸. کیت استخراج miRNA و Small RNA
همه RNAها اندازه یکسانی ندارند.اگر هدف آزمایش شما استخراج miRNA یا Small RNA باشد، استفاده از یک کیت Total RNA معمولی همیشه بهترین انتخاب نیست.کیتهای اختصاصی Small RNA/miRNA با هدف بازیابی بهتر مولکولهای RNA کوچک طراحی شدهاند.این محصولات در پروژههای زیر استفاده می شوند:
- Gene Regulation
- Biomarker Discovery
- Cancer Research
- Molecular Diagnostics Research
۹. کیت استخراج cfDNA
Cell-Free DNA یا cfDNA، DNA آزاد موجود در مایعات بدن مانند خون و پلاسماست.استخراج cfDNA با استخراج معمولی DNA ژنومی تفاوت دارد؛ زیرا مقدار DNA هدف میتواند بسیار کم باشد و اندازه قطعات DNA نیز اهمیت پیدا میکند.به همین دلیل کیتهای اختصاصی cfDNA Extraction برای این کاربرد توسعه داده شدهاند.کاربرد این کیتها در تحقیقات مرتبط با:
- Liquid Biopsy
- Cancer Research
- Biomarker Research
- NGS
- Digital PCR
فناوری های مورد استفاده در کیت استخراج
حالا به یکی از مهمترین قسمتهای انتخاب کیت استخراج می رسیم : کیت دقیقاً چگونه DNA یا RNA را جدا میکند؟
چند فناوری اصلی در کیتهای تجاری مورد استفاده قرار میگیرند.
استخراج با ستون سیلیکا | Silica Spin Column
در این روش، DNA یا RNA در شرایط مناسب به غشای سیلیکا متصل می شود.سپس: Bind → Wash → Elute انجام می شود.مزیت مهم این روش، سادگی و نیاز به تجهیزات نسبتاً معمول آزمایشگاهی است؛ به همین دلیل Spin Column همچنان یکی از فرمتهای بسیار رایج برای استخراج دستی و Low-to-Medium Throughput محسوب می شود.
استخراج با ذرات مغناطیسی | Magnetic Beads
در روش Magnetic Bead، اسید نوکلئیک به ذرات مغناطیسی متصل می شود.سپس با استفاده از مگنت، Beadها از محلول جدا شده و مراحل شست وشو و Elution انجام میشود.یکی از مزیتهای مهم این فناوری، قابلیت اتوماسیون و مناسب بودن آن برای تعداد زیاد نمونه است.به همین دلیل Magnetic Bead Extraction در سیستمهای Automated و High-throughput کاربرد زیادی دارد.
استخراج با رزین تبادل یونی | Anion Exchange
در برخی روشهای خالصسازی، بهخصوص در محصولات مرتبط با پلاسمید، از Anion Exchange Resin استفاده می شود.این فناوری میتواند برای تولید DNA با خلوص بالا و کاربردهای مشخص مورد استفاده قرار گیرد.در محصولات تجاری مختلف، فناوریهای Silica، Anion Exchange و Magnetic Bead در کنار یکدیگر برای کاربردهای مختلف ارائه میشوند.
روشهای استخراج آلی
روشهای قدیمیتر و برخی روشهای رایج آزمایشگاهی بر پایه استخراج آلی مانند Phenol/Chloroform هستند.این روشها میتوانند اقتصادی باشند، اما در مقایسه با بسیاری از کیتهای مدرن، مراحل دستی بیشتری دارند و استفاده از مواد شیمیایی نامطلوبتری را به همراه دارند.به همین دلیل بسیاری از آزمایشگاهها برای کار روتین به سمت کیتهای ستونی یا Magnetic Bead حرکت کردهاند.
کیت استخراج ستونی بهتر است یا Magnetic Bead؟
پاسخ یکسانی برای همه آزمایشگاهها وجود ندارد.
اگر تعداد نمونه کم است:
Spin Column میتواند انتخاب بسیار مناسبی باشد.
زیرا تجهیزات مورد نیاز معمولاً سادهتر است و برای استخراج دستی چند نمونه گزینه مناسبی محسوب میشود.
اگر تعداد نمونه زیاد است:
Magnetic Bead مزیت بیشتری پیدا میکند، بهخصوص اگر قصد استفاده از سیستم اتوماتیک داشته باشید.
در سیستمهای High-throughput، فرمت Magnetic Bead میتواند امکان پردازش تعداد زیادی نمونه را فراهم کند و نیاز به برخی مراحل سانتریفیوژ را کاهش دهد.بنابراین سؤال درست این نیست که:
“کدام روش بهتر است؟“
بلکه باید پرسید:
“کدام روش برای نمونه و Workflow آزمایشگاه من مناسبتر است؟“
هنگام خرید کیت استخراج به چه نکاتی توجه کنیم؟
قیمت کیت استخراج نباید تنها معیار تصمیمگیری باشد.
قبل از خرید، این موارد را بررسی کنید:
۱. نوع نمونه : اول از همه مشخص کنید نمونه شما چیست.خون، بافت، سلول، باکتری، گیاه، سواب، پلاسما و FFPE نیازهای متفاوتی دارند.
۲. نوع اسید نوکلئیک : مشخص کنید هدف شما:
DNA، RNA، Viral DNA/RNA، Plasmid، miRNA یا cfDNA است.
۳. مقدار نمونه ورودی : حجم یا وزن نمونه اولیه روی عملکرد کیت تأثیر دارد.
۴. حجم Elution : اگر DNA یا RNA با غلظت بالا نیاز دارید، حجم Elution اهمیت زیادی دارد.
۵. Yield : مقدار DNA یا RNA بازیابیشده باید با نیاز آزمایش شما مطابقت داشته باشد.
۶. Purity : فقط مقدار DNA/RNA مهم نیست؛ خلوص نیز اهمیت دارد.
برای DNA معمولاً نسبت A260/A280 و A260/A230 بهعنوان شاخصهای رایج بررسی خلوص استفاده میشوند.
۷. کاربرد نهایی : این سؤال بسیار مهم است:
DNA/RNA استخراج شده قرار است کجا استفاده شود؟
PCR؟ qPCR؟ RT-qPCR؟ NGS؟ Cloning؟ Transfection؟
هرکدام ممکن است نیاز متفاوتی داشته باشند.
۸. تعداد نمونه : اگر روزانه ۵ نمونه استخراج میکنید، یک راهکار مناسب با آزمایشگاهی که روزانه 200 یا 500 نمونه پردازش میکند متفاوت است.
۹. Manual یا Automated : اگر آزمایشگاه شما دستگاه Extraction دارد، باید کیتی انتخاب شود که با پلتفرم مورد استفاده سازگار باشد.
یک اشتباه رایج: انتخاب کیت فقط بر اساس Yield :
گاهی هنگام خرید کیت استخراج فقط یک عدد دیده میشود: Yield = X µg اما Yield بالا الزاماً به معنای بهترین کیت نیست.
ممکن است یک کیت DNA زیادی تولید کند، اما DNA به اندازه کافی خالص یا مناسب کاربرد موردنظر نباشد.
برای یک آزمایشگاه مولکولی، ترکیبی از : Yield + Purity + Integrity + Reproducibility + Downstream Compatibility اهمیت دارد.
در واقع بهترین کیت استخراج، لزوماً کیتی نیست که بیشترین DNA یا RNA را تولید کند؛ بلکه کیتی است که اسید نوکلئیک مناسب برای آزمایش شما را با کیفیت و تکرارپذیری مناسب تولید کند.
کیت استخراج DNA یا RNA را از کجا تهیه کنیم؟
انتخاب تأمین کننده معتبر به اندازه انتخاب خود کیت اهمیت دارد.در خرید کیت استخراج باید به موارد زیر حتما توجه کنید مانند:
- اصالت محصول
- شرایط نگهداری
- تاریخ انقضا
- شرایط حمل
- وجود Protocol معتبر
- پشتیبانی فنی
- سازگاری محصول با نمونه و کاربرد موردنظر
برندهای معتبر این حوزه نیز سبد بسیار گستردهای از کیتهای DNA، RNA، پلاسمید، Viral Nucleic Acid و محصولات تخصصیتر ارائه میکنند. برای مثال، QIAGEN مجموعهای گسترده از محصولات خالصسازی DNA و RNA را بر اساس نوع نمونه، فرمت، Throughput و امکان پردازش دستی یا اتوماتیک ارائه میکند.
یاس ژن؛ تأمین کیت استخراج برای کاربردهای مختلف آزمایشگاهی
در انتخاب کیت استخراج، یک محصول واحد نمیتواند پاسخگوی تمام نیازهای آزمایشگاه باشد.به همین دلیل در انتخاب محصول باید ابتدا نوع نمونه، نوع اسید نوکلئیک، تعداد نمونه ها و کاربرد نهایی مشخص شود.یاس ژن کوثر با ارائه محصولات و تجهیزات تخصصی آزمایشگاههای تحقیقاتی و مولکولی، میتواند در انتخاب و تأمین محصولات مورد نیاز برای استخراج و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک به آزمایشگاهها و پژوهشگران کمک کند.اگر برای آزمایشگاه خود به دنبال کیت استخراج DNA، کیت استخراج RNA، کیت استخراج پلاسمید، کیت استخراج DNA/RNA ویروسی، کیت استخراج DNA باکتری، کیت استخراج گیاهی یا کیتهای تخصصی تر هستید، بهتر است قبل از خرید، نوع نمونه و کاربرد نهایی را مشخص کنید تا محصول مناسب انتخاب شود.
برترین شرکتهای تولیدکننده کیت استخراج اسیدهای نوکلئیک
معرفی برندهای معتبر جهانی در زمینه استخراج DNA و RNA
| ردیف | شرکت | کشور | برند / سری کیت | حوزه محصولات |
|---|---|---|---|---|
| 01 | QIAGEN | هلند | QIAamp / DNeasy / RNeasy | استخراج DNA و RNA |
| 02 | Thermo Fisher Scientific | آمریکا | MagMAX / PureLink | DNA / RNA و استخراج مغناطیسی |
| 03 | Roche Diagnostics | سوئیس | MagNA Pure / High Pure | استخراج و خالصسازی DNA / RNA |
| 04 | Promega | آمریکا | Maxwell / ReliaPrep | DNA / RNA و سیستمهای اتوماتیک |
| 05 | Merck / MilliporeSigma | آلمان / آمریکا | GenElute | استخراج DNA و RNA |
| 06 | Agilent Technologies | آمریکا | Genomics / Sample Preparation | خالصسازی و آمادهسازی نمونه |
| 07 | Bio-Rad | آمریکا | Aurum | استخراج DNA و RNA |
| 08 | Takara Bio | ژاپن | Takara Nucleic Acid Purification | استخراج DNA / RNA و NGS |
| 09 | Zymo Research | آمریکا | Quick-DNA / Quick-RNA / ZymoBIOMICS | DNA / RNA و استخراج میکروبی |
| 10 | Macherey-Nagel | آلمان | NucleoSpin / NucleoMag | DNA / RNA و استخراج مغناطیسی |
| 11 | Norgen Biotek | کانادا | Norgen DNA / RNA Kits | DNA / RNA و نمونههای بیولوژیک |
| 12 | Omega Bio-tek | آمریکا | E.Z.N.A. / Mag-Bind | DNA / RNA و Magnetic Beads |
| 13 | New England Biolabs (NEB) | آمریکا | Monarch | DNA / RNA Purification |
| 14 | Analytik Jena | آلمان | innuPREP / innuMAG | استخراج DNA / RNA |
| 15 | Bioneer | کره جنوبی | AccuPrep / ExiPrep | DNA / RNA و استخراج اتوماتیک |
| 16 | Geneaid Biotech | تایوان | Genomic DNA / Viral RNA | استخراج DNA / RNA ویروسی |
| 17 | MagBio Genomics | آمریکا | MagBind | Magnetic Bead Purification |
| 18 | MP Biomedicals | آمریکا | FastDNA | DNA / RNA و نمونههای پیچیده |
| 19 | LGC Biosearch Technologies | انگلستان / آمریکا | Nucleic Acid Purification | ژنومیک و خالصسازی اسید نوکلئیک |
| 20 | Magen Biotech | چین | Magnetic Bead / Column Kits | استخراج DNA / RNA |
کیت استخراج یکی از پایهایترین محصولات در Workflow آزمایشهای مولکولی است.اما “کیت استخراج” یک محصول واحد نیست.از Genomic DNA Extraction و Total RNA Extraction گرفته تا Plasmid Extraction، Viral DNA/RNA Extraction، Bacterial DNA Extraction، Plant DNA/RNA Extraction، FFPE، miRNA و cfDNA، برای هر کاربرد میتوان راهکار اختصاصی پیدا کرد.از طرف دیگر، فناوری مورد استفاده نیز اهمیت دارد:
Silica Column : برای بسیاری از استخراجهای دستی و روتین انتخابی ساده و کاربردی است.
Magnetic Beads : برای اتوماسیون و پردازش تعداد بالاتر نمونهها بسیار مهم است.
Anion Exchange : در برخی کاربردهای تخصصی، بهخصوص خالصسازی پلاسمید، مورد استفاده قرار میگیرد.
بنابراین هنگام خرید کیت استخراج، به جای اینکه فقط بپرسیم: “این کیت چند میکروگرم DNA میدهد؟” بهتر است بپرسیم: “این کیت برای نمونه من، هدف من و آزمایش بعدی من مناسب است یا نه؟“چون کیفیت یک آزمایش مولکولی، از همان مرحلهای شروع میشود که DNA یا RNA را از نمونه استخراج میکنیم.
Add a Comment